Pengertian HPLC
Kromatografi
cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai
dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan
fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat
berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu.
Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram.
Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
1
JENIS- JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC
dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding
dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase
terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1 .
Kromatografi Adsorbsi
2 .
Kromatografi fase terikat
3 .
Kromatografi penukar ion
4 .
Kromatografi Pasangan ion
5 .
Kromatografi Eksklusi Ukuran
6 .
Kromatografi Afinitas
Beberapa kegunaan dari HPLC :
·
HPLC dengan
prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
·
Zat- zat
dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair
·
Asam-asam
nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori.
· Morfin,
heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
· Dapat
memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
· Digunakan
untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
· Dapat
digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
Kelebihan dan Kekurangan Dalam
Penggunaan HPLC
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi.
Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
·
Mampu
memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.
·
Dapat
dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
·
Dapat
digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
·
Kolom dapat
digunakan kembali.
·
Waktu
analisa cukup singkat.
·
HPLC dapat
digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
·
Dapat
menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
·
Teknik HPLC
dapat dilakukan pada suhu kamar.
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan
larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong
fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan
kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini
akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah.
1.
Pompa
Pompa pendeteksian tetap dapat dibedakan menjadi
pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilakan aliran yang berdenyut
jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis
alas detector yang stabil jika detector peka terhadap aliran. Pompa semprit
menghasilkan aliran yang tak terbatas.
2.
Injector
Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom
(kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan
kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam
system injector, yaitu:
a. Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system
tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi
di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum
: septum yang digunakan pada
KCKT sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat
digunakan pada kinerja sampa 60 – 70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan
dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop
vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
dari 10ยต dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang
sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi
load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve
difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.
3.
Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf.
Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi
kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom
preparative.
4.
Detector
Detector diperlukan untuk mengindera adanya
komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang
baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan
menggapai semua jenis senyawa.
Jenis-jenis detector :
·
UV/Vis
·
Retraktif indeks (RI) detector
·
Konduktifitas decetor
·
Elektroimia detector
·
PDA
·
ELSD
·
MSdectetor
5.
Fase gerak
Fase gerak memiliki syarat-syarat :
·
Murni, tanpa
cemaran
·
Tidakbereaksi
dengan kemasan
·
Sesuai
dengan detector
·
Dapat
melarutkan cuplikan
·
Mempunyai
viskositas rendah
·
Memungkinkan
memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan
- http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kineja_tinggi_hplc/ diakses pada tanggal 26 Januari 2011.
- http://ilmu-kedokteran.blogspot.com/2007/11/kromatografi.html diakses pada tanggal 28 Januari 2011
- http://sectoranalyst.blogspot.com/2011/10/cara-kerja-hplc.htm
